Produkter

Analysen av proteomomfattende fosforyleringshendelser er fortsatt en stor analytisk utfordring på grunn av den enorme kompleksiteten til proteinfosforyleringsnettverk.I dette arbeidet evaluerer vi komplementariteten til Lys-N, Lys-C og trypsin med hensyn til deres evne til å bidra til den globale analysen av fosfoproteomet.En raffinert versjon av sterk kationutveksling med lav pH ble brukt for å effektivt separere N-terminalt acetylerte, fosforylerte og ikke-modifiserte peptider.Totalt 5036 ikke-redundante fosfopeptider kunne identifiseres med en falsk oppdagelsesrate på <1 % fra 1 mg protein ved bruk av en kombinasjon av de tre enzymene.Dataene våre viste at overlappingen mellom fosfopeptiddatasettene generert med forskjellige proteaser var marginal, mens overlappingen mellom to lignende genererte tryptiske datasett ble funnet å være minst 4 ganger høyere.På denne måten muliggjorde den parallelle bruken av Lys-N og trypsin en 72 % økning i antall påviste fosfopeptider sammenlignet med trypsin alene, mens et trypsinreplikateksperiment bare førte til en 25 % økning.Når vi utelukkende fokuserte på trypsin- og Lys-N-dataene, identifiserte vi 4671 ikke-redundante fosfopeptider.Ytterligere analyse av de påviste stedene viste at Lys-N- og trypsin-datasettene ble beriket i signifikant forskjellige fosforyleringsmotiver, noe som ytterligere beviser at multiprotease-tilnærminger er svært verdifulle i fosfoproteomanalyser.