Produkter

Ny høyytelses væskekromatografianalyse for glykosyltransferaser basert på derivatisering med antranilsyre- og fluorescensdeteksjon.

Analyser ble utviklet ved å bruke den unike merkingskjemien til 2-aminobenzosyre (2AA; antranilsyre, AA) for å måle aktivitetene til både β1-4 galaktosyltransferase (GalT-1) og α2-6 sialyltransferase (ST-6) ved hjelp av høyytelsesvæske kromatografi (HPLC) med fluorescensdeteksjon (Anumula KR. 2006. Fremskritt innen fluorescensderivatiseringsmetoder for høyytelses væskekromatografisk analyse av glykoproteinkarbohydrater. Anal Biochem. 350:1-23).N-acetylglukosamin (GlcNAc) og N-acetyllaktosamin ble brukt som akseptorer og uridindifosfat (UDP)-galaktose og cytidinmonofosfat (CMP)-N-acetylneuraminsyre (NANA) som donorer for henholdsvis GalT-1 og ST-6.Enzymatiske produkter ble merket in situ med AA og ble separert fra substratene på TSKgel Amide 80-kolonne ved bruk av normalfase-betingelser.Enzymenheter ble bestemt fra toppområdene ved sammenligning med de samtidig derivatiserte standardene Gal-β1-4GlcNAc og NANA-α2-6 Gal-β1-4GlcNAc.Linearitet (tid og enzymkonsentrasjon), presisjon (intra- og interassay) og reproduserbarhet for analysene ble etablert.Analysene ble funnet å være nyttige for å overvåke enzymaktivitetene under isolering og rensing.Analysene var svært sensitive og utførte lik eller bedre enn de tradisjonelle radioaktive sukkerbaserte målingene.Analyseformatet kan også brukes for å måle aktiviteten til andre transferaser, forutsatt at karbohydratakseptorene inneholder en reduserende ende for merking.En analyse for glykoproteinakseptorer ble utviklet ved bruk av IgG.En kort HPLC-profileringsmetode ble utviklet for separasjon av IgG-glykaner (biantennær G0, G1, G2, mono- og disialylert), noe som lettet bestemmelsen av GalT-1- og ST-6-aktiviteter på en rask måte.Videre bør denne profileringsmetoden vise seg nyttig for å overvåke endringene i IgG-glykaner i kliniske omgivelser.