Produkter

For å spesifikt kvantifisere flere metabolitter av 5-fluorouracil (5-FU) og to endogene monofosfatnukleotider, utviklet vi en original metode basert på en væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS).Denne analysen tillot bestemmelse av: (i) den intracellulære produksjonen av 5-fluor-2'-deoksyuridin-5'-monofosfat (5-FdUMP) fra 5-FU eller 5-fluor-2'-deoksyuridin (5-FdUrd) , (ii) innvirkningen av 5-FdUMP-konsentrasjon på det intracellulære 2'-deoksyuridin-5'-monofosfat (dUMP)/tymidin-5'-monofosfat (TMP) forholdet, og (iii) utskillelsesgraden av 5-FdUMP og 5-FU fra humane dyrkede celler av ABC-transportører.Under våre eksperimentelle forhold ble celler inkubert med 5-FU eller 5-FUrd.Deretter ble cellulære proteiner utfelt av metanol.Denne prosedyren ga høy ekstraksjonsgjenvinning.I tillegg, for å måle 5-FU og 5-FdUMP sekresjon fra celler, utførte vi kvantifisering av disse molekylene i kulturmedium.Media ble enten direkte injisert (5-FU) eller under en fastfase-ekstraksjon ved bruk av Oasis Wax-ekstraksjonskassett (5-FdUMP).Separasjon av analytter ble utført på en dC18 Atlantis 3,5 μm, (100 mm × 2,1 mm id) kolonne med isokratisk modus ved bruk av ammoniumformiatbuffer/metanol/vann (5/5/90, v/v) som mobil fase.Kjøretiden oversteg ikke 6,2 min.Analyttene ble ionisert i en elektrospray-grensesnitt under negativ ion-modus.Vi validerte metoden over et område på 2,5–150 ng mL -1 i henhold til forbindelsene.Intra- og inter-assay-variabiliteten var lavere enn 10 % over syv dager.Alle forbindelsene var stabile i celler eller i kulturmedium når prøvene ble lagret ved -20 ° C i minst to uker, og etter tre fryse-tine-sykluser.Ingen matriseeffekt ble observert i begge medier.